Съдържание
При химични реакции, катализирани от ензим, ензимът понижава необходимото количество енергия за активиране, като временно се свързва със субстрата и го усуква в напрегнато състояние. K (катализатор) или "kcat" за реакцията се отнася до концентрацията, независима от концентрацията, за скоростта, с която определен ензим може да метаболизира субстрат в молекула на продукта. За да изчислят kcat, учените първо смесват няколко епруветки с различни концентрации на субстрата (известен като "ензимен анализ") и ги тестват през постоянни интервали от време със светлинен спектрофотометър, за да измерват нарастващите концентрации на молекулите на продукта. След това тези данни се начертават върху графика и се анализират.
Изчисляване на началните скорости
Начертайте диаграма на концентрацията на продукта спрямо времето за данните от ензимните анализи първата епруветка. Забележка: хоризонталната ос трябва да бъде "време", а вертикалната ос - "концентрация на продукта".
Изчислете линейната регресионна линия за точките от данни, които сте начертали в раздел 1, стъпка 1. Докато Excel и графичните калкулатори могат лесно да определят този линеен модел, можете да получите оценка на наклона на регресионните линии, като разделите разликата в концентрацията на продукта между съседни данни точки от разликата им във времето.
Запишете наклона на линейната регресионна линия от раздел 1, стъпка 2 като "начална скорост на реакцията (Vo)." Забележка: в модела на регресионната линия "= m + b" коефициентът "m" е наклона.
Повторете стъпки 1, 2 и 3 за останалите епруветки в анализа.
Изчисляване на Vmax
Начертайте обратната концентрация на субстрата за всяка епруветка спрямо обратната на нейната начална скорост на реакция (от раздел 1, стъпка 4). Например, ако началната скорост за епруветка с начална концентрация на субстрата 50 микромолара (uM) беше 80 uM / s, обратните стойности биха били 1/50 uM за концентрацията на субстрата и 1/80 uM / s за началната скорост. Забележка: обратната концентрация на субстрата трябва да бъде на хоризонталната ос, а обратната начална скорост трябва да бъде на вертикалната ос.
Забележка: концентрацията на субстрата трябва да бъде на хоризонталната ос, а началната скорост на реакцията трябва да бъде на вертикалната ос.
Определете линейната регресионна линия за диаграмата, която сте начертали в раздел 2, стъпка 1. Забележка: тъй като ще трябва да знаете y-пресичане за регресионната линия, трябва да въведете точките от раздел 2, стъпка 1 в Excel или a графичен калкулатор и използвайте вградената функционалност за регресионно моделиране.
Разделете 1 с y-пресичане от линейната регресионна линия. Това ще ви даде стойността на обратната стойност на Vmax, максималната скорост на реакция за ензима. Забележка: ако моделът на линейна регресия приема формата "= m + b", тогава стойността на "b" ще бъде y-пресичане. Разделете 1 на "b", за да изчислите обратната стойност на Vmax.
Разделете 1 според резултата от раздел 2, стъпка 3, за да изчислите действителната стойност на Vmax.
Определете концентрацията на ензима в първоначалния анализ (вижте суровите данни). Забележка: концентрацията на ензима е една и съща за всички епруветки; само концентрациите на субстрата варират в анализа.
Разделете Vmax (от раздел 2, стъпка 4) според концентрацията на ензима (от раздел 2, стъпка 5). Резултатът е стойността на Kcat.