Съдържание
- Електрофорезата има ограничен анализ на пробите
- Измерванията на електрофорезата не са прецизни
- Изисква се съществена начална проба
- Само някои молекули могат да бъдат визуализирани
- Електрофорезата е ниска пропускателна способност
Гел електрофорезата е техника, при която биологичните молекули са отделени една от друга и идентифицирани при биологични изследвания или медицинска диагностика. От своето развитие през 70-те години тези техники са безценни при идентифицирането на гени (ДНК) и генни продукти (РНК и протеин) от научноизследователски интерес. През последните години се появиха по-нови техники, които дават по-голяма специфика и подробности за случващото се в живите системи. Въпреки че тези методи не са заместили електрофорезата и усъвършенстваните манипулации могат да разширят жизнеспособността на техниката, важно е да се осъзнае какво може и какво не може да направи електрофорезата с гел.
Електрофорезата има ограничен анализ на пробите
Електрофорезата е специфична за всяка тъкан, която сте взели за проба. Например, ако пуснете Южна петна (вид електрофореза) върху буза тамбур, вие гледате гени от епителните клетки на бузата и никъде другаде в тялото си. Понякога това може да бъде от полза, но изследователите често се интересуват от по-широко разпространени ефекти.
Техники като in situ хибридизация (ISH) могат да вземат част от тъканта и да анализират генната експресия на всяка малка площ от тази проба.По този начин изследователите могат да разгледат всяка мозъчна област в проба с ISH, докато електрофорезната техника може да разглежда само няколко области наведнъж.
Измерванията на електрофорезата не са прецизни
Гел електрофорезата може ефективно да отделя подобни протеини с различно тегло (това е техника, наречена Western blotting). Може да ги раздели по-точно чрез техника, известна като 2d електрофореза; това е често срещано в протеомиката.
За съжаление, всички измервания, направени от тази техника, в най-добрия случай са полуколичествени. За да се получи точната маса (тегло) на протеините, трябва да се използва масспектроскопия, след като протеинът се пречисти чрез електрофореза. Освен това сравняването на относителните количества различни молекули разчита на плътността на лентата (тъмнина) на различни петна върху гела. Този метод има известна степен на грешка и пробите обикновено се изпълняват многократно, за да се получат чисти резултати.
Изисква се съществена начална проба
Електрофорезата е техника за изолиране и визуално идентифициране на различни биомолекули. Това става чрез преминаване на електрически ток през гела за отделяне на заредени молекули с различно тегло. Ако молекулата, която ви интересува, не е достатъчно често срещана, нейната лента ще бъде практически невидима и трудна за измерване.
ДНК и РНК могат да бъдат амплифицирани донякъде, преди да се извърши електрофореза, но не е практично да се направи това с протеини. Следователно е необходима голяма тъканна проба за провеждане на тези анализи. Това може да ограничи полезността на техниката, особено в медицинския анализ. На практика е невъзможно да се извърши електрофореза върху проби от една клетка; проточна цитометрия и имунохистохимия се използват по-често за оценка на клетъчната експресия на протеини. Техника, наречена PCR, е отлична за точното измерване на малки количества РНК.
Само някои молекули могат да бъдат визуализирани
Електрофорезата е отлична за разделяне и идентифициране на биомолекули със средни и големи размери. Въпреки това, много от молекулите, които изследователите искат да разгледат, са по-малки; малки хормони, невротрансмитери и йони не могат да бъдат измерени чрез електрофореза. Това е по две причини: те не реагират правилно с препарата за електрофореза (обикновено техника, наречена SDS PAGE), и дори да го направят, те са твърде малки, за да се отделят правилно и биха изхвърлили дъното на гела. Вместо това тези молекули се измерват чрез техники като RIAAs (радиоимуноанализи) и ELISAs (анализ на имуносорбант, свързан с ензимите).
Електрофорезата е ниска пропускателна способност
Гел електрофорезата обикновено е с ниска пропускливост, което означава, че не произвежда данни особено бързо. Контрастна електрофореза, при която можете да разгледате малко шепа РНК молекули наведнъж, с PCR (полимеразна верижна реакция), която може едновременно да оцени хиляди проби. По същия начин, проточната цитометрия може да направи измервания от хиляди отделни клетки и да направи сложни корелации, докато електрофорезата разглежда клетките масово и не може да направи такива фини различия. PCR и поточната цитометрия представляват съответно масивни паралелни и серийни процеси, като и двете далеч надминават способностите на електрофорезата за генериране на данни от изследвания.