Съдържание
- ДНК клониране: дефиниция и преглед на процеса
- Методът вектор на плазмидите
- Методът PCR (полимеразна верижна реакция)
- Съвместно използване на методите за клониране на плазмидния вектор и PCR DNA
- Примери за клониране на ДНК за биотехнологии
- Примери за клониране на ДНК за изследвания
- Примери за клониране на ДНК за генна терапия
Възможно е да се клонират цели организми като овцете Доли, но клонирането на ДНК е различно. Той използва техники за молекулярна биология идентични копия на ДНК последователности или единични гени.
Чрез методите на генното инженерство се идентифицират и изолират сегменти от генетичния код на ДНК. ДНК клонирането след това копира последователностите на нуклеиновата киселина в сегментите.
Получените идентични копия могат да бъдат използвани за допълнителни изследвания или за биотехнологични приложения. Често генът, който се копира, кодира протеин, който може да бъде част от медицинското лечение. ДНК технология включително ДНК клониране подкрепя разбирането за това как работят гените и как генетичният код на хората влияе върху функционирането на тялото.
ДНК клониране: дефиниция и преглед на процеса
ДНК клонирането е процесът на молекулярната биология на изработване на идентични копия на ДНК сегменти, разположени в хромозомите, които съдържат генетичния код на напредналите организми.
Процесът генерира големи количества от прицелни ДНК последователности, Целта на клонирането на ДНК е да произвеждат самите целеви ДНК последователности или да произвеждат протеините, кодирани в целевите последователности.
Наричат се двата метода, използвани при клонирането на ДНК плазмиден вектор и полимеразна верижна реакция (PCR), В плазмиден вектор метод, ДНК нишките се нарязват с помощта на рестрикционни ензими за получаване на ДНК фрагменти и получените сегменти се вмъкват в клониращи вектори, наречени плазмиди за по-нататъшно дублиране. Плазмидите се поставят в бактериални клетки, които след това произвеждат ДНК копия или кодирани протеини.
В PCR метод, сегментът от ДНК вериги, които трябва да се дублират, е маркиран с наречени ензими грундове, Ензимът от полимераза прави копия на маркираната част от веригата на ДНК. Този метод не използва рестрикционни ензими и може да произвежда клонирана ДНК от малки проби. Понякога двата метода на ДНК технологиите се използват заедно, за да се включат най-добрите характеристики на всеки в цялостната реакция.
Методът вектор на плазмидите
Векторът на метода се отнася до плазмида, използван за задържане на целевия ДНК сегмент, който ще бъде клониран. Плазмидите са малки кръгли нишки на нехромозомна ДНК намира се в много организми, включително бактерии и вируси.
Бактериалните плазмиди са векторът, използван за поставяне на целевия ДНК сегмент в бактериални клетки за по-нататъшно дублиране.
Избор и изолиране на целевата ДНК: Преди да започне процесът на клониране на ДНК, ДНК последователностите трябва да бъдат идентифицирани, особено началото и краищата на ДНК сегментите.
Такива ДНК последователности могат да бъдат намерени чрез използване на съществуваща клонирана ДНК с известни последователности или чрез изследване на протеина, получен от целевата ДНК последователност. След като последователността е известна, съответните рестрикционни ензими могат да бъдат използвани.
Разрязване на целевата ДНК с рестрикционни ензими: Рестрикционните ензими са избрани така, че да търсят ДНК кода в началото и в края на целевите последователности.
Когато рестрикционните ензими намерят специална кодирана последователност от базови двойки, наречени рестрикционни сайтове, те се прикрепят към ДНК на това място и се навиват около молекулата на ДНК, разрязвайки нишката. Изрязаните ДНК сегменти, съдържащи целевата последователност, вече са достъпни за дублиране.
Избор на плазмиден вектор и поставяне на целевата ДНК: Подходящ плазмид в идеалния случай съдържа същите ДНК кодиращи последователности като ДНК веригата, от която е отрязана целевата ДНК. Кръговата верига на ДНК на плазмида се нарязва със същите рестрикционни ензими, които са били използвани за изрязване на целевата ДНК.
А Ензим ДНК лигаза се използва за насърчаване на свързването на ДНК сегмент, а краищата на целевия ДНК сегмент се свързват с отрязаните краища на плазмидната ДНК. Целевата ДНК сега представлява част от кръговата плазмидна верига на ДНК.
Поставяне на плазмида в бактериална клетка: След като плазмидът съдържа последователността на ДНК, която трябва да бъде клонирана, действителното клониране може да се осъществи, като се използва процес, наречен бактериална трансформация, Плазмидите се вкарват в бактериална клетка като Е. coli и клетките с новите ДНК сегменти ще започнат да произвеждат копия и съответните протеини.
При бактериална трансформация клетките-гостоприемници и плазмидите се инкубират заедно при телесна температура за около 12 часа. Клетките абсорбират част от плазмидите и ги третират като собствена плазмидна ДНК.
Събиране на клонирана ДНК и протеини: Повечето плазмиди, използвани за клониране на ДНК, имат гени за антибиотична резистентност включени в тяхната ДНК. Тъй като бактериалните клетки абсорбират новите плазмиди, те стават резистентни към антибиотици.
Когато културата се третира с антибиотици, оцеляват само онези клетки, които са абсорбирали новите плазмиди. Резултатът е чиста култура от бактериални клетки с клонирана ДНК. След това тази ДНК може да бъде събрана или съответният протеин да бъде произведен.
Методът PCR (полимеразна верижна реакция)
Методът PCR е по-прост и копира съществуващата ДНК на място. Това не изисква рязане с рестрикционни ензими или въвеждане на плазмидни ДНК последователности. Това го прави особено подходящ за клониране на ДНК проби с ограничен брой нишки на ДНК. Въпреки че методът може да клонира ДНК, той не може да се използва за производството на съответния протеин.
Разкриване на нишките на ДНК: ДНК в хромозоми е плътно навита в структура с двойна спирала. Загряване на ДНК до 96 градуса по Целзий в процес, наречен денатуриране прави молекулата на ДНК да се размотава и разделя на две направления. Това разделяне е необходимо, тъй като само един низ от ДНК може да бъде клониран наведнъж.
Избор на праймери: Както при клонирането на ДНК с плазмиден вектор, ДНК последователностите, които трябва да бъдат клонирани, трябва да бъдат идентифицирани със специален акцент върху началото и краищата на ДНК сегментите. Праймерите са ензими, които се прикрепят към специфични последователности на ДНК код и те трябва да бъдат избрани, за да маркират целевите ДНК сегменти. Правилните праймери ще се прикрепят към последователностите на ДНК молекулите, за да маркират началото и краищата на целевите сегменти.
Отгряването на реакцията за свързване на праймерите: Нарича се охлаждане на реакцията до около 55 градуса по Целзий каляване, Когато реакцията изстине, праймерите се активират и се прикрепят към веригата на ДНК във всеки край на целевия ДНК сегмент. Праймерите действат само като маркери, а нишката на ДНК не е необходимо да се реже.
Създаване на идентични копия на целевия ДНК сегмент: В процес, наречен разширение, към реакцията се добавя чувствителният към топлина ензим TAQ полимераза. След това реакцията се нагрява до 72 градуса по Целзий, активирайки ензима. Активният ензим на ДНК полимераза се свързва с праймерите и копира ДНК последователността между тях. Първоначалният процес на секвениране и клониране на ДНК е завършен.
Увеличаване на добива на клонирана ДНК: Първоначалният процес на отгряване и разширение създава сравнително малко копия от наличните сегменти на ДНК веригата. За да се увеличи добивът чрез допълнителна репликация на ДНК, реакцията се охлажда отново, за да се активира отново праймерите и се оставят да се свържат с други нишки на ДНК.
След това повторното нагряване на реакцията активира отново ензима полимераза и се получават повече копия. Този цикъл може да се повтори 25 до 30 пъти.
Съвместно използване на методите за клониране на плазмидния вектор и PCR DNA
Методът на плазмидния вектор разчита на достатъчно първоначално снабдяване с ДНК, за да се разреже и вмъкне в плазмиди. Твърде малкото оригинално ДНК води до по-малко плазмиди и бавен старт на клониране на производството на ДНК.
Методът PCR може да произведе голямо количество ДНК от няколко оригинални нишки на ДНК, но тъй като ДНК не се имплантира в бактериална клетка, производството на протеин не е възможно.
За да се получи протеинът, кодиран в фрагментите на ДНК, който да бъде клониран от малка първоначална ДНК проба, двата метода могат да се използват заедно и те могат взаимно се допълват. Първо методът PCR се използва за клониране на ДНК от малка проба и за получаване на много копия.
Тогава PCR продуктите се използват с плазмидния вектор метод за имплантиране на произведената ДНК в бактериални клетки, които ще произведат желания протеин.
Примери за клониране на ДНК за биотехнологии
Молекулярната биология използва клониране на гени и репликация на ДНК за медицински и търговски цели. Бактериите с клонирани ДНК последователности се използват за производство на лекарства и замяна на вещества, които хората с генетични разстройства не могат да произвеждат сами.
Типичните приложения включват:
Биотехнологията също използва генетично клониране в селското стопанство, за да създаде нови характеристики на растенията и животните или да подобри съществуващите характеристики. Тъй като се клонират повече гени, броят на възможните употреби нараства експоненциално.
Примери за клониране на ДНК за изследвания
ДНК молекулите съставляват малка част от материала в жива клетка и е трудно да се изолират влиянията на многото гени. Методите за клониране на ДНК доставят големи количества от специфична последователност на ДНК за изследване и ДНК произвежда протеини точно както в оригиналната клетка. ДНК клонирането дава възможност за изследване на тази операция за различни гени в изолация.
Типичните приложения за научни изследвания и ДНК технологии включват изследване:
Когато се клонират повече ДНК последователности, е по-лесно да се намерят и клонират допълнителни последователности. Съществуващите клонирани ДНК сегменти могат да бъдат използвани за определяне дали нов сегмент съвпада със стария и кои части са различни. Идентифицирането на целева ДНК последователност след това е по-бързо и по-точно.
Примери за клониране на ДНК за генна терапия
в генна терапия, клониран ген се представя на клетките на организъм, чийто естествен ген е повреден. Жизненоважен ген, който произвежда протеин, необходим за специфична функция на организма, може да бъде мутиран, променен от радиация или засегнат от вируси.
Когато генът не работи правилно, важно вещество липсва от клетката. Генната терапия се опитва да заменете гена с клонирана версия, която ще произведе необходимото вещество.
Генната терапия все още е експериментална и малко пациенти са излекувани с помощта на техниката. Проблемите се състоят в идентифицирането на единичния ген, отговорен за медицинското състояние и доставянето на много копия на гена до правилните клетки. Тъй като клонирането на ДНК става все по-широко разпространено, генната терапия се прилага в няколко специфични ситуации.
Последните успешни приложения включват:
Генната терапия е едно от най-обещаващите приложения за клониране на ДНК, но други нови приложения вероятно ще се разпространят, тъй като се изучават повече ДНК последователности и се определя тяхната функция. ДНК клонирането доставя суровината за генно инженерство в необходимите количества.
Когато ролята на гените е известна и правилната им функция може да бъде осигурена чрез заместване на дефектни гени, много хронични заболявания и дори рак могат да бъдат атакувани и лекувани на генетично ниво с помощта на ДНК технология.
Свързано съдържание: