Съдържание
Петното по Грам е диференцирана процедура за оцветяване, която показва кои бактерии са грам-положителни или грам-отрицателни въз основа на техния цвят на петна. Ацетонният алкохол е един реагент, използван в този процес за осигуряване на цветово разграничаване. Грам-положителните бактерии имат плътен пептидогликанов слой и оцветяват лилаво, докато грамотрицателните микроорганизми имат малко до пептидогликанов слой и оцветяват розово.
Първична петна-кристална виолетка
След като се приготви слайд от бактериална проба, за оцветяване на пробата първо се използва кристално виолетово. В този момент както грам-положителните, така и грамотрицателните бактерии ще изглеждат лилави. Обикновено кристалната виолетка се нанася върху пързалката за 30 секунди, преди да се отмие излишното петно с вода. Кристалната виолетка може да прилепне малко към пептидогликановите слоеве, така че не всички първични петна ще се отмият с водата.
Байц-Йод
След това йодът се добавя към пробата за една минута. Той действа като морда, който служи за фиксиране на багрила в процес на оцветяване. Йодът изпълнява тази функция, като се свързва с кристалната виолетка и създава неразтворим комплекс, който се прилепва много по-добре към плътния пептидогликанов слой, открит в грам-положителните бактериални клетки, отколкото само в кристалната виолетка. Няма стъпка на измиване с вода след добавяне на йода.
Decolorizer-Алкохол
Като обезцветяващо средство може да се използва ацетон или етилов алкохол. Алкохолът разтваря липиди, намиращи се във външната клетъчна мембрана на грамотрицателни бактерии, което позволява кристално виолетово-йодния комплекс да изтече от по-тънкия пептидогликанов слой. Алкохолът се добавя за 10 до 20 секунди; тя се излива върху пързалката, докато целият йод се измие и изтичането е безцветно. В този момент от процеса на оцветяване по Грам, грамотрицателните бактерии са безцветни, докато грам-положителните бактерии все още задържат кристално виолетовото. След като завършите пързалката, трябва да се изплакнете с вода, за да спрете обезцветяващия ефект.
Оцветете-Сафранинът
След това се добавя Safranin за увеличаване на видимостта и контраст с безцветните грамотрицателни бактерии. Петното прави тези бактерии да изглеждат розови под микроскопа. Тъй като петното се добавя към цялата проба, то оцветява и грам-положителни бактерии, но по-тъмната от кристалната виолетка крие по-светлия розов цвят на сафранина. След като пробата от слайда се залее със сафранин за около минута, водата се използва за измиване на излишното петно, което не се е прилепило към бактериалните клетки.