Съдържание
- Ензими за ограничаване и сайтове за ограничение
- Правилната ориентация
- Лигирането на лепкави краища изисква по-малко ДНК
- Различните ензими могат да дадат същия лепкав край
Молекулярното клониране е общ метод на биотехнологиите, с който всеки студент и изследовател трябва да бъде запознат. Молекулярно клониране с помощта на вид ензим, наречен рестрикционен ензим, за разрязване на човешката ДНК на фрагменти, които след това могат да бъдат вкарани в плазмидната ДНК на бактериална клетка. Рестрикционните ензими разрязват двойно ДНК на две. В зависимост от рестрикционния ензим, изрязването може да доведе до лепкав или тъп край. Лепливите краища са по-полезни при молекулярното клониране, защото гарантират, че фрагментът на човешката ДНК се вкарва в плазмида в правилната посока. Процесът на лигиране или сливане на фрагменти от ДНК изисква по-малко ДНК, когато ДНК имат лепкави краища. И накрая, многократните ензими за ограничаване на края могат да произведат един и същ лепкав край, въпреки че всеки ензим разпознава различна рестрикционна последователност. Това увеличава вероятността вашият ДНК регион, който представлява интерес, да бъде изрязан от лепкави ензими.
Ензими за ограничаване и сайтове за ограничение
Рестрикционните ензими са ензими, които разрязват разпознаването на специфични последователности на двуверижна ДНК и разрязват ДНК наполовина при тази последователност. Разпознатата последователност се нарича рестрикционен сайт. Рестрикционните ензими се наричат ендонуклеази, тъй като те отрязват двуверижна ДНК, което нормално съществува ДНК на места, които са между краищата на ДНК. Има повече от 90 различни рестрикционни ензими. Всеки разпознава отделен сайт за ограничение. Рестрикционните ензими разцепват съответните им рестрикционни места 5000 пъти по-ефективно от други сайтове, които те не разпознават.
Правилната ориентация
Рестрикционните ензими се предлагат в два общи класа. Те или нарязват ДНК на лепкави, или тъпи. Лепливият край има къс участък от нуклеотиди, градивните елементи на ДНК, който е неспарен. Този несдвоен регион се нарича надвес. Казва се, че надвесът е лепкав, защото иска и ще се сдвои с друг лепкав край, който има допълваща се надвесна последователност. Лепкавите краища са като отдавна изгубени близнаци, които се стремят да се прегърнат плътно един след друг. От друга страна, тъпите краища не са лепкави, защото всички нуклеотиди вече са сдвоени между двете нишки на ДНК. Предимството на лепкавите краища е, че фрагмент от човешка ДНК може да се побере само в бактериален плазмид в една посока. За разлика от това, ако и човешката ДНК, и бактериалният плазмид имат тъпи краища, човешката ДНК може да бъде вкарана главата на опашката или от опашката до главата в плазмида.
Лигирането на лепкави краища изисква по-малко ДНК
Въпреки, че ДНК с краищата на пръчките имат по-лесно намиране помежду си поради своята „лепкавост“, нито лепкавите, нито тъпите краища могат да се слеят в непрекъснато парче ДНК. Образуването на непрекъснато парче ДНК, което е напълно свързано, изисква ензим, наречен лигаза. Лигазите свързват основите на нуклеотидите в лепкавите или тъпи краища, което води до непрекъсната верига от нуклеотиди. Тъй като лепкавите краища се намират по-бързо поради привличането им един към друг, процесът на лигиране изисква по-малко човешка ДНК и по-малко плазмидна ДНК. Тъпите краища на ДНК и плазмидите са по-малко склонни да се открият, и следователно лигирането на тъпите краища изисква да се постави повече ДНК в епруветката.
Различните ензими могат да дадат същия лепкав край
Местата на рестрикция са разположени в целия геном на организмите, но не са равномерно разположени. В плазмидите те могат да бъдат проектирани така, че да бъдат разположени непосредствено един до друг. Учените, които искат да изрежат фрагмент от човешката ДНК от човешкия геном, трябва да намерят места за рестрикция, които са отпред и отзад в района на фрагмента. Освен че гарантират, че ДНК фрагмент е вкаран в правилната посока, различни лепкави ензими могат да създадат един и същ лепкав край, въпреки че разпознават различни рестрикционни последователности. Например, BamHI, BglII и Sau3A имат различни последователности за разпознаване, но произвеждат един и същ GATC лепкав край. Това увеличава вероятността да има лепливи крайни ограничителни сайтове, които обграждат вашия човешки ген от интерес.