Съдържание
- Серийни разреждания
- Подготовка на плаки за изчисляване на титър
- Преброяване и изчисляване на вирусен титър
- Предупреждения
Изчисляването на титър за вирус е сложен начин да се каже, че учен брои броя на вирусите в определена проба. За да изчислят титрите на вирусите, учените заразяват плаки с растящи бактерии с вирусни разтвори в различни концентрации и определят броя на вирусите в оригиналния разтвор, като преброяват бактериите, които са умрели поради вирусна инфекция.
Серийни разреждания
Сложете ръкавици, напълнете 10 епруветки с 9 мл бульон и ги маркирайте "10 ^ -1", "10 ^ -2", "10 ^ -3" и така нататък до "10 ^ -10." Тези епруветки ще бъдат използвани за вирусни серийни разреждания, използвани за изчисляване на фагерен титър. Тъй като вирусите могат да нараснат до невероятно високи концентрации, трябва да ги разреждате, за да ги преброите ефективно. Всяка епруветка представлява десеткратно разреждане на вируса.
Вземете 1 ml от вирусната култура, за която искате да изчислите фагов титър, и я прехвърлете в епруветката, озаглавена „10 ^ -1“ с пипета. Разбъркайте добре тубата. Това е първото ви десеткратно разреждане.
Вземете 1 ml от смесената култура от вашата епруветка с надпис "10 ^ -1" и я прехвърлете с нова пипета в следващата епруветка с надпис "10 ^ -2".
Продължете този модел, за да създадете серийни серии за разреждане. Ще завършите с 9 епруветки по 9 мл и 1 туба от 10 мл. Вирусните товари във вашите епруветки ще бъдат разредени от 10 пъти (първата ви епруветка) или 100 пъти (втората ви епруветка) до десет милиарда пъти (последната ви епруветка).
Подготовка на плаки за изчисляване на титър
Вземете 10 епруветки с триптон мек агар и 10 плочки Петри и ги маркирайте, за да съответстват на вашите серийни епруветки за разреждане.
Разхлабете капачките, за да не изскочат в жегата и след това поставете епруветките си с агар в чаша с вряла вода. Това ще разтопи агара, така че можете да го излеете в чинии на Петри.
Прехвърлете вашите епруветки в гореща водна баня с температура най-малко 45 градуса по Целзий. Това ще гарантира, че агарът ви не се втвърдява в епруветките, преди да имате възможност да го излеете в чаша на Петри.
Добавете две капки бактериална култура към вашия агар и разбъркайте внимателно. Това са бактериите, които ще бъдат убити, което ви позволява да преброите броя на вирусни частици в конкретен разтвор.
Добавете 1 ml от всяко серийно разреждане към съответната епруветка с агар, докато епруветките са все още в банята с гореща вода. Например, 1 ml от вашето серийно разреждане 10 ^ -1 трябва да влезе в епруветката с агар с надпис "10 ^ -1."
Смесете всяка епруветка и след това изсипете всяка епруветка в чинията на Петри със съответния етикет. Това ще създаде тънък слой агар, който е бил инокулиран с бактерии и вируси във всяка плака. Оставете плочите да растат за една нощ в инкубатор.
Преброяване и изчисляване на вирусен титър
Извадете чиниите си от инкубатора и ги разгледайте. Трябва да видите мътни участъци в цялата чиния, където са нараснали бактерии, с изключение на малки прозрачни петна, наречени плаки. Тези плаки са петна от мъртви бактерии и всяка плака представлява един вирус.
Намерете плака, която има между 30 и 300 плаки и пребройте точния брой на табелите.
Вземете броя на плаките в чинията и умножете по 10. Ако преброите 157 плаки, ще получите 1570.
Умножете числото, което сте получили в предишната стъпка, с обратната на числото в епруветката за разреждане. Например, ако избраната от вас плоча беше плочата 10 ^ -5, ще умножите 1570 по 10 ^ 5, за да получите 157000000. Това крайно число е вашият фагов титър и представлява броя на вирусите на ml от оригиналната ви култура.