Съдържание
Генетичното синьо на клетката е кодирано в генетичния й материал или в ДНК. Тъй като ДНК никога не напуска ядрото на клетката, за да може тази информация да попадне в цитоплазмата, където пребивават други протеини и биохимични компоненти, е необходимо първо да се преписва ДНК в пратеника на РНК (тРНК или поли (А) РНК). След това тази иРНК се превръща в протеини, които изпълняват много функции на клетката. За откриване или количествено определяне на много редки мРНК, направяне на сонди за микрочипове или изграждане на библиотеки от допълнителни ДНК молекули, тРНК трябва да бъде изолирана. Въпреки това, общата екстракция на РНК (т.е. цялата РНК в клетка) и последващата изолация на тРНК не са взаимно изключващи се процеси; първата трябва да се извърши, за да може да се екстрахира тРНК.
Изолиране на тРНК от общата РНК
TRIzol хомогенизация: Общата РНК включва всички мРНК, трансферна РНК, рибозомна РНК и други некодиращи РНК. За да ги отдели от другите клетъчни компоненти, клетката първо се отваря, за да освободи съдържанието си. Това става чрез повторно суспендиране на клетки, гранулирани чрез центрофугиране (въртене с висока скорост) в TRIzol Reagent (Life Technologies). Други версии на TRIzol (като TRI Reagent на Ambion) работят подобно.
Тотална РНК изолация: серия от центрофугиране се използва за разделяне на различните компоненти (протеини, ДНК, РНК) на клетката на слоеве или фази, в рамките на суспензията. Горната фаза с жълт цвят е съставена от мазнини и може да се изхвърли. Желаната фаза е оцветена в червено, съдържа общата РНК и се задържа. След извършване на екстракция на фенол-хлороформ и серия промивки с алкохол, използвайки изопропанол и етанол, РНК може да се гранулира за изолиране на мРНК. Добавете RNase инхибитори, за да предотвратите разграждането на този ензим на общата РНК.
Извличане на мРНК: Обичайно е да се използва комплект за изолиране на мРНК, тъй като домашните лабораторни протоколи не генерират големи количества високо пречистени мРНК. Търговските комплекти включват FastTrack 2.0 на Invitrogen или изолационен комплект за поли (A) на чистата иРНК на Ambion. Тези основни стъпки са общи за такива комплекти:
а) Смесете инхибирания RNase буфер за лизис, предоставен в комплекта, с до 300 микролитра обща РНК.
b) Загрейте за 5 минути при 65 градуса по Целзий и след това веднага охладете пробата върху лед за една минута.
в) Смесете това с 0,5 М натриев хлорид и след това напълно разтворете Oligo dT (олигодеокситимидилова киселина) в тази проба.
d) Центрофугирайте тази проба и възстановете супернатантата, която се промива няколко пъти в серия от свързващи и ниско солени буфери, предоставени в комплектите.
д) Елуирайте иРНК няколко пъти, докато се получи обем, определен в комплект (например 500 микролитра).
е) Утайка от елуата чрез утаяване на натриев ацетат и етанол. Повторно суспендиране в до 20 микролитра вода, обработена с диетилпирокарбонат (DEPC).
ж) Съхранявайте при -80 градуса по Целзий и проверете за качество и количество чрез спектрофотометрия.