Съдържание
Когато работите с високоефективна течна хроматография (HPLC), доброто калибриране е абсолютно необходимо за осигуряване на надеждни и качествени резултати. Правилното калибриране на HPLC инструмент започва с изготвянето на подходящ стандарт за калибриране. В повечето случаи калибрирането всъщност изисква серия от стандарти за увеличаване на концентрацията, за да се получи това, което е известно като калибрационна крива. Това е начертана линия и свързано уравнение, което описва връзката между концентрацията на химичното вещество, за което се тества, и реакцията на HPLC детектора.
Определете химичното вещество, което искате да тествате за използване на HPLC ("аналита"). Например, можете да изпробвате серия безалкохолни напитки за съдържание на фруктоза, в този случай фруктозата би била анализираната.
Получавайте количество от анализирания химикал с подходяща чистота. Обикновено чистотата трябва да бъде над 99% и аналитът трябва да бъде закупен от реномирана компания за доставки на химически вещества. В случай на фруктоза, например, бихте закупили чиста фруктоза от доставчик на химикали, а не от магазин за хранителни стоки.
Определете максималните и минималните очаквани концентрации на аналита в пробите, които възнамерявате да тествате върху HPLC. В случай на безалкохолни напитки бихте изследвали етикетите на напитките и бихте определили най-ниското и най-високо съдържание на фруктоза сред напитките, които ще тествате. Имайте предвид, че първоначалната проба (безалкохолната напитка) може да бъде разредена или манипулирана по друг начин по време на подготовката за анализ (в зависимост от използвания HPLC метод) и така концентрацията на аналита в действително инжектираните върху HPLC проби може да бъде променена. Концентрацията на аналитите в пробите, теглени върху HPLC, трябва да се вземе предвид.
Определете разтворителя, в който ще разтворите аналита си, за да съставите стандарти за калибриране. Този разтворител трябва да бъде в състояние да разтвори правилно аналита в сравнително широк диапазон на концентрация (поне толкова висок, колкото в пробите, които възнамерявате да тествате). Освен това този разтворител в идеалния случай трябва да бъде доста подобен на "подвижната фаза:" разтворителя, използван за пренасяне на проби през HPLC инструмента.
Изчислете количеството на аналита, необходимо за изготвяне на "стандартен запас" решение на аналита. Това се установява чрез умножаване на необходимата концентрация на основния стандарт по желания обем. Концентрацията на аналита в този разтвор трябва да бъде поне 10% по-висока от най-високата очаквана концентрация на пробата. Ако най-високата очаквана концентрация на фруктоза в пробата за безалкохолни напитки е 8 грама / 100 милилитра, тогава основният стандарт може да се направи до концентрация от 10 грама фруктоза / 100 милилитра. Разумният обем е 500 милилитра, следователно 8/100 мл х 500 мл = 40 грама фруктоза.
Претеглете необходимото количество аналит до подходящо ниво на точност. Често е подходяща стойност на теглото в грамове, прецизни до един или два десетични знака, но може да е необходима по-голяма точност при някои методи.
Претегленият аналит се прехвърля в обемна колба с необходимия обем и се добавя желаният разтворител към марката за пълнене в колбата. Използването на обемна колба (вместо градуирана чаша например) увеличава прецизността на стандартната стойност на концентрацията. Уверете се, че целият аналит се прехвърля в колбата; използвайте част от разтворителя, за да го измиете, ако е необходимо.
Спрете обемната колба и внимателно разклатете или обърнете, докато аналитът се разтвори напълно.
Направете серия от различни разреждания на основния стандарт, като прехвърлите известни обеми от основния стандарт в обемни колби, като използвате пипети за точно прехвърляне, след което добавете разтворител. Най-ниската стандартна концентрация трябва да бъде под най-ниската очаквана проба за анализ. В примера за безалкохолни напитки, ако най-ниската очаквана концентрация на фруктоза в проба е 2 грама / 100 мл, тогава може да се направи стандарт от 1 грам / 100 мл. Това ще стане чрез десетократно разреждане на стандартния запас. Стандартната серия трябва да включва общо 5 или 6 концентрации, така че ще са необходими допълнителни разреждания за получаване на стандарти от може би 3, 5 и 8 грама фруктоза / мл. Вече имате серия от стандартни решения, с които да калибрирате HPLC.